Dilahirkan dengan nama Nancy D'Alesandro kepada ibu bapa Amerika Syarikat berketurunan Itali di Baltimore, Maryland, [2] Pelosi ialah anak bongsu antara enam orang adik-beradik. Beliau terlibat dalam bidang politik pada usia awal. Bapanya, Thomas D'Alesandro, Jr., merupakan ahli Kongres untuk negeri Maryland serta Datuk Bandar Baltimore. Semasa bapanya menjawat datuk bandar, Pelosi membantunya mengekalkan lejar tentang sokongan-sokongan politik yang dihutang dan diberikan. [3] Abangnya, Thomas L. J. D'Alesandro III, juga pernah menjawat Datuk Bandar Baltimore antara tahun 1967 hingga tahun 1971.

Pelosi lulus daripada sekolah tinggi Institut Notre Dame di Baltimore dan kemudiannya dari Kolej Trinity (kini Universiti Trinity Washington) di Washington, D.C. pada tahun 1962. Di kolej ini, beliau bertemu dengan Paul Pelosi, bakal suaminya. Apabila Nancy Pelosi berkahwin, beliau pindah ke tempat asal suaminya di San Francisco. Abang iparnya seorang ahli Majlis Bandaraya dan Kaunti San Francisco, sebuah lembaga penyelia bandar raya.

Sebaik sahaja anak bongsu antara lima orang anaknya menyertai tingkatan atas sekolah tinggi, Nancy Pelosi berusaha bersungguh-sungguh dalam politik Demokrat untuk menjadi pengerusi parti bagi kawasan California Utara dan bergading bahu dengan Phillip Burton, ahli Kongres ke-5 California yang juga daripada Parti Demokrat.

Pelosi juga merupakan ahli lembaga kehormat untuk Pertubuhan Nasional Wanita Amerika Itali.